实验操作喂饭教学—逆转录（我走过的弯路你们别走，祝大家实验顺利）

• 大家正在进行阿鲁提取的逆转录操作。
• 非特异性逆转录与特异性逆转录的试剂不同。
• 讲解如何配制逆转录试剂的具体步骤。
• 需要注意逆转录引物的设计。
• 最后，演示如何使用仪器进行逆转录。

嗯，大家看一下哈，就是我们现在在做这个呃阿鲁提取，来到逆转录的这一步操作。首先大家看到这上面和下面，上面是指非特异性的逆转录，画面是特异性的逆转录，它的试剂是不一样的。

以我自己的试剂为例，我非特异性逆转录用的是TAKA的036，我特意限逆转录使用的塔卡尔的037。那什么时候用非特异性，什么时候特异性呢？

一般来说，非特异性就是指你要把你提到的所有的阿里内全部转入，全力就逆转录成cDNA；特异性逆转录呢，顾名思义是指某一个特定的RNA，我要让它尽可能多的逆转录成我需要的cDNA。一般来说mRNA或者说有些特殊的RNA，我们都可以用侧翼系列转录。

那么两个试剂呢，它是不一样的。这是我自己的实验试剂的配比，你们的实验试剂配比要根据你们的试剂以及你们的实验需要去安排。

你比方说阿维A，它是500纳克，是根据你的阿维A浓度来算，你需要加入多少的微升。然后再用无mix的、五成的mix的那个混合液加两微升，再用无米水配比到十微升。你没有无美水，也可以用第一PC水。那么特异性逆转录呢，它就要更复杂一点，除了五层的mix之外，还要加入阿鲁维酶和特异性的逆转录引物，各0.5ml，200.5ml。

然后这个特异性的逆转录引物呢，是需要你根据你自己的逆转录出来的那个基因它的序列去设计的。那么我们今天演示一下非特异性逆转录所需要的步骤。

我首先要加500纳克的阿鲁A进去，因为我是配10微升的体系。如果你们想一次性逆转录比较多，比方说我想配成20微升的体系，那就按比例放大，也就是阿鲁A是1000纳克。

然后你的记得阿鲁RT mix mixture混合物是四微升，水再配到20微升。因此我根据我的阿维A浓度来算出来的话，我需要加4.5微升的阿鲁A。

所以我就加了4.5微升的阿鲁A，500纳克。我现在在加那个RT mix。加二维，4.5倍的A，加两倍的Mixture。接下来还剩下3.5微升的无美水补助到十微升。是3.5微升。

我这管的尝试试剂反应体系就已经暂时配完了。那么你们在配完之后，要尽快在你的管子上，或者是一开始就在管子上面写上你自己的名字。比如像我这样，我会提前先把管子的名字写上去。这样的话我加样的时候，就知道哪个加哪个。

加完之后还是按照老方法去那边瞬时离心，把液体甩到管底部，弹一弹，再理清一下，让你的液体充分混匀，就可以拿出去。

好，皮虾啦！走吧。那么特异性逆转录呢，一般来说，视频米尔阿鲁N的时候采用特异性逆转录。

像我刚刚说的那样，首先我们要先加阿鲁A进去，也是十微升提取500纳克。如果你自己想要逆转录20微升的话，你就把你的体系成倍翻就行。

所以根据我自己的阿鲁A的浓度来算的话，我加500纳克是4.5微升，只有五微升。五成的mixture还是两微升的体系。

在逆转录当中，你还需要加入阿鲁RT酶，就是逆转录的酶，这个是0.5微升。一定要打干净，因为是很少的量，所以一定要打的很干净。

然后还有逆转录引物，逆转录引物需要根据你自己的基因的序列去设计。这个公司可以帮你设计的，自己去找就行。也是0.5微升。

最后加入无美水，2.5微升。那么同样的，把你的管子拿到瞬移机上面去，液体从管壁上甩下来，弹一弹，再混合几遍，这样才可以拿去披萨进行逆转录。

走吧！然后我们逆转录就是用这台机器啊，这后面是开关，先开机。特异性逆转录和非特异性逆转录的程序是不一样的，要根据你自己的实验试剂以及实验需求来决定。可能有时候需要你自己试一下，看看结果。

打开盖子，大家看到了，这里是一个96孔的，我们一般会把管子放在中间，因为中间的受热比较均匀，所以一般放在中间。盖上盖子，选择你的程序，如果你是新程序，就选new protocol；如果是保存过的程序就选save。

我就选一个我常用的程序。我是136。如果因为我自己知道我的程序哈，我如果是特意性逆转录，我就是TAKA的037的程序。如果是非特异性的逆转录，那就是036的程序。大家注意，第一步的室温度是不太一样的，所以在设置时一定要注意。

选择好程序之后就点击run。注意你的管体系是怎样的，我这次是10微升，所以我就把其改成十。逆转录的体系最大不要超过20微升，10微升或者20微升是可以的，不能再大了。

否则的话，这个管本来受热也就那样，可能最后的实验结果不会那么精确。我们一般最多是20微升的体系，选OK，然后它就会跑了。

好，然后这里显示时间，等到时间完成你再过来就行了。