实验操作—WB总结

• 最近收到很多朋友关于实验过程中的问题
• 实践是解决问题的关键
• 每个实验目的和步骤都需要认真思考
• 本期视频总结关于western blot的一些异常问题
• 交流是学习的最佳方式
• 特别关注实验细节和问题排查

刚好我最近看到有些朋友在我视频底下问我一些相关的问题。就比方说实验过程中的一些问题。有一些问题的话，我跟大家说实话，你们有些人问的问题，你要自己去实践之后才能得到一些解决办法。

就不同的实验目的，你用的是不同的试剂，可能的实验方法也是不一样的。你多想想和实验室里面的师兄师姐或师弟师妹，包括同届的朋友去相互交流，其实学东西学得是最快的。我也是在和我周围的一些朋友交流的时候才发现学得是最快的。就是他可能遇到过这个问题，他的解决方法是什么，然后你可以选择适合自己的方法，这样会快一些。

那么今天这一期视频的主要目的呢，就是来讲一下weston blot当中可能会出现的一些异常条带和异常的问题。相当于是western blot的一个总结。大家在做实验的时候常常会遇到一些异常的条带，我觉得异常条带的分析主要是因为每个条带它的结果会有所不同。就是比方说出现一个微笑型的条带，或者是哭泣型的条带，或者这个条带是斜的等等之类的，可能有非常多的原因。

可能从电泳的条件、制备胶的过程中，以及转膜的操作等都可能会出现问题。我觉得与其一个一个条带进行分析，我不如直接把整个过程可能出现的一些细节方面问题再重复一下，供大家思考或者对照自己的实验步骤，来看一下有没有一些问题。

那么以手灌胶为例，一个好的western blot实验它是从制备胶开始，接着就是电泳、转膜、封闭，然后到一抗、二抗和显色。封闭之后可能还需要稍微清洗，用TBST或者BPBST，这一步最多也要清洗一下，整个大概流程是这样的。

每一步出现了问题，结果都有可能出现问题。但是大家在做这个western blot的时候，因为它涉及的步骤很多，细节也很多，所以若干环节出现了问题，最终的结果也很可能会受到影响。好，那么我们先从制备胶这一步开始说起。

手灌胶方面，市面上有两种胶，一种是手制胶，手灌胶的话有大家自己配制的，还有那种快速封闭试剂盒的胶；另外一种是预制胶，预制胶就很好理解，就是那种已经预先制作好的，在盒子里面像一块块饼干一样，你拿来拆开就可以用的胶。

首先，一定要注意你的玻璃板是否干净。如果玻璃板没有洗干净，上面有粘附胶丝或者前面的电解质留下，制备的胶就会不均匀。跑胶时底下的分离胶浓度不均匀，就会影响条带形状。

首先第一，你的玻璃板洗得干不干净。我们认为洗干净是指在水下冲洗时发现玻璃板上面没有附着水珠，就算是洗干净了。第二，我自己有个习惯是用干燥的玻璃板。洗完的玻璃板放到烘干箱干燥，目的是在灌胶时不容易被稀释，因为自来水里面的电解质可能影响到胶的浓度，导致干燥后的玻璃板非常透亮好看。

第三，玻璃板是否完整。如果玻璃板的边角有缺口，尤其是短板那边的缺口，容易导致漏胶，跑电泳的时候就会发现没有完整的条带出现，影响观察效果。

至于制备胶，首先你配置的胶一定要混匀再倒进去，尤其是下面的分离胶。在后续的准备中也要注意，玻璃板拿出来干燥后最好稍微冷却，使它达到室温再使用。同时，制作完的胶尽量在合理的时间内用完，避免因时间过长导致胶的质量下降。

此外，验证试剂是否有效也很重要，尤其是保存温度和时间要注意。使用的快速封闭试剂需在-20°的冰箱中保存，拿出时要避免温水或自来水温度即可。大家可以考虑分装试剂，这样能有效减少试剂浪费。

使用预制胶时，注意查看说明书，确保不会影响电流速度。高质量的制备是必要的，与此同时，玻璃板也要保持干净，以避免影响电泳效果。

从接下来的环节来看，提取蛋白的过程中，操作的环境也相当重要，尤其是放在冰上，防止蛋白质降解。因此，在从冰箱取出的蛋白样品需要迅速放入4°C冷藏，确保操作的整个过程中温度的稳定，以提高得出的结果。

根据实际情况，您需要根据实验要求设计上样量，并确保在试剂中的比例与实验条件保持一致。包括在样品上样时，进行充分的漩涡混合，避免沉淀。

随着电泳的阶段，需使用到新鲜的电泳液并保持内外槽电泳液平衡，避免因液体泄漏而影响电泳质量。建议电泳液中使用蒸馏水以保证电解质纯度，提升电泳的效果。

转膜阶段，选用适合的转膜液并保证液体温度，以提高转膜效果。转膜之后，清洗还需使用清洁的试剂盒，以保证后续分析的准确性。

封闭液选择时，务必考虑其浓度。不同的实验需选择合适的封闭液以确保抗体检测的顺利进行。同时，显色阶段时，合理保存荧光试剂与使用条件，也会影响最终结果。

最后，西方印迹在整个实验过程中要不断回顾每一步的操作，务必保留交流与探讨的时间。无论实验结果如何，量化分析自己所做的每一步，随时调整操作才能获得最优结果。

每位学者都在逐步摸索中寻找最佳实验方案，希望大家在实验过程中能互相学习，从经验中总结，不断进步，逐步实现各自的实验目标。